Selecionado pela NASA em 1984, Mark Lee concluiu seu treinamento em 1985 e assumiu várias funções técnicas, incluindo atividades extraveiculares (EVA) e sistemas da Estação Espacial. Lee atuou como comunicador de espaçonaves (CAPCOM) e ocupou vários cargos de liderança no Escritório de Astronautas.

A carreira espacial de Lee inclui quatro missões, nas quais percorreu mais de 21 milhões de quilômetros e orbitou a Terra 517 vezes. Ele voou como especialista de missão na STS-30, onde ajudou a lançar a sonda espacial Magellan para a exploração de Vênus, a primeira missão de ciência planetária dos EUA lançada desde 1978. Na STS-47, atuou como comandante de carga útil, supervisionando 44 experimentos japoneses e americanos nas áreas de ciências da vida e processamento de materiais.

Durante a missão STS-64, ele realizou a primeira caminhada espacial sem amarras em uma década, totalizando 6 horas e 51 minutos de EVA. Sua última missão, a STS-82, foi a segunda missão de manutenção do Telescópio Espacial Hubble, na qual ele realizou três caminhadas espaciais que somaram 19 horas e 10 minutos, instalando novos espectrômetros e instrumentos de substituição, além de modernizar o isolamento do telescópio.

Lee se aposentou da NASA e da Força Aérea em 1º de julho de 2001.