Seleccionado por la NASA en 1984, Mark Lee completó su formación en 1985 y asumió diversas funciones técnicas, entre ellas la actividad extravehicular (EVA) y los sistemas de la Estación Espacial. Lee trabajó como comunicador de la nave espacial (CAPCOM) y ocupó varios puestos de liderazgo en la Oficina de Astronautas.

La carrera espacial de Lee incluye cuatro misiones, viajando más de 13 millones de millas y orbitando la Tierra 517 veces. Voló como especialista de misión en la misión STS-30, donde ayudó a desplegar la nave espacial Magallanes de exploración de Venus, la primera misión científica planetaria estadounidense lanzada desde 1978. En la misión STS-47, actuó como comandante de la carga útil, supervisando 44 experimentos japoneses y estadounidenses de ciencias de la vida y procesamiento de materiales.

Durante la misión STS-64, realizó el primer paseo espacial sin sujeción en una década, registrando 6 horas y 51 minutos de EVA. Su última misión, STS-82, fue la segunda misión de mantenimiento del telescopio espacial Hubble, en la que realizó tres paseos espaciales por un total de 19 horas y 10 minutos, instalando nuevos espectrómetros e instrumentos de repuesto y mejorando el aislamiento del telescopio.

Lee se retiró de la NASA y de las Fuerzas Aéreas el 1 de julio de 2001.